Acremonium chrysogenum

Acremonium chrysogenum
Acremonium chrysogenum na Sabouradově agaru
Vědecká klasifikace
Říše	Fungi
Podříše	Dikarya
Oddělení	Ascomycota
Pododdělení	Pezizomycotina
Třída	Sordariomycetes
Podtřída	Hypocreomycetidae
Řád	Hypocreales
Čeleď	Hypocreaceae
Rod	Acremonium
Binomické jméno
Acremonium chrysogenum
Některá data mohou pocházet z datové položky.

Acremonium chrysogenum (syn. Cephalosporium acremonium) je mikroskopická vláknitá houba (mikromyceta) řadící se mezi Ascomycota ^[1]. Jedná se o aerobní mikroorganismus, žijící běžně v prostředí ^[2][3]. Významný je zejména díky své produkci antibiotika cefalosporinu C ^[4].

Taxonomické zařazení

Acremonium chrysogenum patří do říše Fungi, podříše Dikarya, phyla Ascomycota, podphyla Pezizomycotina, třídy Sordariomycetes, podtřídy Hypocreomycetidae, řádu Hypocreales, čeledi Hypocreaceae a rodu Acremonium ^[1]. Jelikož neustále dochází k reklasifikaci mikromycet, lze tuto mikromycetu nalézt i pod starším názvem Cephalosporium acremonium ^[5].

Obecná charakteristika

Acremonium chrysogenum roste dobře na obecných mikromycetních růstových médiích při teplotě okolo 25 – 30 °C ^[6][3]. Vyznačuje se osamocenými akulovitými fialidy nebo lehce větvenými konidiofory, které vyrůstají z vegetativních hyf a nesou buď vlhký shluk, suché řetízky konidií nebo obojí ^[6][7]. Konidie bývají podlouhlé, 1 – 3 µm x 4 – 8 µm velké ^[3]. Hyfy mohou být někdy propleteny dohromady a tvořit provazy široké několik buněk v průměru ^[3][7]. V makroskopickém měřítku tvoří hyfy bělavé, nažloutlé, narůžovělé nebo nazelenalé ploché, hladké kolonie, které časem zarůstají uvolněnými hyfami a získávají práškovitou, semišovou, vločkovitou nebo vatovitou strukturu ^[6][3].

A. chrysogenum je převážně saprofyt žijící ve vlhkém prostředí, zároveň bylo ovšem potvrzeno, že se jedná o oportunního patogena, který může způsobovat infekce u rostlin a imunosuprimovaných obratlovců ^{[8][9][10][11]}. Nachází se v půdě, na rostlinných zbytcích a hnijících houbách ^[7][11]. Vlhké spory jsou šířeny větrem, na kapkách vody nebo pomocí hmyzu ^[3]. Často se také vyskytuje na stavebních materiálech na bázi celulosy (stropní desky, lepenka, dřevěné materiály), opět zejména ve vlhkém prostředí ^[11]. K degradaci celulosy a dalších sloučenin uhlíku potom dochází především působením extracelulárně produkovaných celulas a reaktivních forem kyslíku ^[11]. Navíc produkuje A. chrysogenum sloučeniny s Mn³⁺ a minerály oxidů Mn³⁺ a Mn⁴⁺, které jsou silnými oxidačními činidly a dále podporují degradaci polymerů uhlíku, zároveň s koloběhem kovů v prostředí ^[11]. Produkce těchto vysoce reaktivních sloučenin je růstově specifická, částečně závislá na buněčné diferenciaci, typu využívaného substrátu, typu sekretovaných proteinů a mezidruhové interakci v prostředí, přestože související molekulární mechanismy nejsou plně objasněny ^[11].

A. chrysogenum je aerobní organismus, zvýšené koncentrace kyslíku v médiu jsou kritické pro maximální produkci antibiotika cefalosporinu C ^[4][12]. Rozmnožuje se pohlavně ^[13], dlouhou dobu ovšem nebyl znám žádný sexuální stav nebo teleomorfní forma a vědělo se jen o asexuálním typu rozmnožování, proto bylo A. chrysogenum dříve zařazeno do skupiny imperfektních hub (Deuteromycetes) ^{[3][14][15][16]}. V roce 2008 byla ovšem provedena analýza transkriptomu A. chrysogenum a identifikována exprese dvou MAT genů (typ párování, ang. mating-type), přičemž byla nalezena i cDNA kódující domnělý feromonový receptor a enzymy signální dráhy feromonové odezvy ^[13].

Cefalosporin C

Biotechnologicky nejvýznamnějším metabolitem A. chrysogenum je antibiotikum cefalosporin C. Jedná se o β-laktamové antibiotikum, které inhibuje syntézu strukturálních komponent bakteriální buněčné stěny ^[17][18]. Často se používá jako alternativa u pacientů, kteří jsou senzitivní na penicilin ^[17]. V roce 2003 představovala β‑laktamová antibiotika (zejména peniciliny a cefalosporiny) hlavní světové biotechnologické produkty s celosvětovým ziskem z prodeje 15 miliard amerických dolarů a pokrývala 65 % celosvětového trhu s antibiotiky ^[4]. V roce 2017 byl celosvětový zisk z prodeje samotného cefalosporinu C 10 miliard ^[18].

Modifikací β-laktamového kruhu a postranního řetězce bylo připraveno více než 20 derivátů s řadou antibakteriálních vlastností ^[4][17]. Tyto deriváty byly uspořádány do skupin na základě jejich aktivity: cefalosporiny první generace (např. cefalothin) jsou širokospektrá antibiotika účinná proti grampozitivním i mnoha gramnegativním bakteriím, včetně rodů Staphylococcus, Streptococcus a mnoha kmenů Escherichia coli ^[17]. Cefalosporiny druhé (např. cefuroxim) a třetí (např. ceftazidim) generace bývají účinnější proti gramnegativním bakteriím, které se staly rezistentními vůči cefalosporinům první generace ^[17]. Cefalosporiny druhé generace jsou účinné například proti kapavce způsobené Haemophilus influenzae a abscesům způsobeným Bacteroides fragilis ^[17]. Schopnost mnoha cefalosporinových derivátů pronikat do mozkomíšního moku je také činí účinnými při léčbě meningitidy ^[17].

Biosyntetická dráha cefalosporinu C začíná ze tří důležitých produktů primárního metabolismu - aminokyselinových prekurzorů: L-cysteinu, L-valinu a L-α-aminoadipové kyseliny ^[19][20]. Kyselina α-aminoadipová je v A. chrysogenum nejen prekurzorem cefalosporinu C, ale také klíčovým meziproduktem biosyntetické dráhy aminokyseliny lysinu ^[21]. Cystein je pro biosyntézu cefalosporinu odvozen od methioninu přes reverzní transsulfurační dráhu pomocí cystationin-γ-lyasy ^[19][22]. Methionin je velmi důležitý nejen jako prekurzor pro cystein, ale také stimuluje transkripci genů pro enzymy biosyntetické dráhy cefalosporinu C a biosyntetickou dráhu reguluje ^[19]. Navíc bylo prokázáno, že má methionin vliv na morfologickou diferenciaci mycelia, která je spojená s produkcí cefalosporinu ^[20][23]. Biosyntetická dráha β-laktamových antibiotik dále pokračuje přes isopenicilin N, odkud se v A. chrysogenum ubírá směrem k cefalosporinu C, v jiných organismech v tomto bodě odbočuje k penicilinu G nebo cefamycinu N ^[19].

Biotechnologická produkce

Produkce cefalosporinu C je aerobní proces, který může být proveden konvenčně s volnými buňkami v tankovém bioreaktoru nebo nekonvenčně s buňkami imobilizovanými v náplňovém nebo airlift bioreaktoru ^[18]. V obou případech lze fermentaci provádět vsádkově, fed-batch i kontinuálně, vždy je ovšem kladen důraz na dostatečnou aeraci a míchání, jelikož je dostupnost kyslíku hlavním limitujícím faktorem procesu ^[4][18][2].

Velký vliv na produkci sekundárního metabolitu má samozřejmě fyziologický stav mikrobiální kultury ^[24]. Kromě toho ovšem záleží na velkém množství faktorů od typu substrátů po způsob kultivace. Bylo prokázáno, že suplementace hůře‑metabolizovatelným zdrojem uhlíku, jako je sójový olej, stimuluje produkci cefalosporinu C ^[4][20]. Využití takového substrátu je podstatně náročnější a vede k pomalejšímu růstu, kdy se vegetativní mycelium přeměňuje na mnohobuněčné stádium artrospor, které má za následek vyšší dostupnost kyslíku a produkci cefalosporinu C ^[4]. Velmi významný stimulační efekt na biosyntézu cefalosporinu C má methionin, zejména D‑isomer, přidaný do média ^[25][26]. Lepší stimulační aktivita D‑isomeru je důsledkem toho, že ho A. chrysogenum pomaleji přijímá a není tolik dostupný pro intracelulární degradaci ^[19]. Intracelulárně je D-isomer převáděn na L-formu ^[19].

Pro další zvýšení výtěžku produkce cefalosporinu C v A. chrysogenum byly uplatněny různé strategie, například navýšení počtu kopií genů pro enzymy biosyntetické dráhy cefalosporinu ^[4][12], případně transformace homologními geny z příbuzných organismů, jejichž produkty (enzymy biosyntetické dráhy cefalosporinu C) mají vyšší aktivitu ^[27]. Zvýšená produkce cefalosporinu C byla také pozorována po transformaci produkčního kmene DNA vektorem obsahujícím gen pro kyslík‑vazebný hemový protein ^[28] nebo po snížení aktivity H⁺-ATPasy na plasmatické membráně A. chrysogenum vedoucí ke zvýšenému množství ATP dostupného pro produkci cefalosporinu C ^[29].

Za zmínku také stojí, že limitujícím faktorem biosyntézy cefalosporinu C je nejen přísun aminokyselinových prekurzorů a kofaktorů z primárního metabolismu, ale také směřování centrálních metabolitů do metabolických drah vedoucích k biosyntéze těchto prekurzorů a kofaktorů ^[20][30].

Fermentační médium je navrženo tak, aby poskytovalo základní suroviny pro růst a produkci cefalosporinu C ^[18]. Jako zdroj uhlíku jsou využívány glukosa, fruktosa, sacharosa nebo laktosa spolu se složitějšími látkami jako výše zmiňovaný sójový olej nebo olej arašídový ^[4][18][20]. Kromě složitějších zdrojů uhlíku mohou morfologickou diferenciaci mycelia ovlivňovat i zdroje dusíku, např. močovina, kvasniční extrakt, kasein, dusičnany nebo amonné soli, které mohou rovněž pomoci s udržením optimálního pH v průběhu procesu ^[4][18][31]. Často se jako levný zdroj používá šrot ze sójových bobů nebo bavlníkových semen, případně kukuřičný výluh, který je rovněž bohatý na aminokyseliny, vitamíny, organické kyseliny a stopové prvky ^[4]. pH fermentace by mělo být udržováno mezi 6,2 a 7,0 a teplota mezi 24 °C a 28 °C ^[4][31]. Rozpuštěný kyslík by měl být udržován na 30 % nasycení a výše ^[4]. Pokud je potřeba, je možné přidat silikonový olej na zamezení pěnění ^[18].

Průběh kultivace je charakterizován rapidní spotřebou dobře využitelného zdroje uhlíku (sacharosy) na vytvoření biomasy v počátku procesu ^[18]. S postupem fermentace je tento dobře využitelný substrát spotřebován a je nahrazen složitějším, který navodí morfologickou diferenciaci a zvýšenou produkci cefalosporinu C ^[4][32]. S postupem fermentace je také nutné do bioreaktoru přidat chemické inhibitory a blokátory k zamezení interakcí surového cefalosporinu C s jinými sloučeninami, které by mohly vést k jeho znehodnocení ^[18]. Kritické jsou rovněž izolační a purifikační kroky, které začínají prudkým ochlazením média na 3 – 5 °C s následným odstraněním pevného mycelia filtrací nebo centrifugací ^[4][32]. Jedním z problémů bývá to, že na konci fermentace obsahuje médium kromě cefalosporinu C i malé množství jeho prekurzorů, například penicilinu N ^[4]. Účinné separace může být dosaženo například použitím aktivního uhlí nebo neionické pryskyřice, které přednostně adsorbují cefalosporin C před penicilinem N a dalšími kontaminujícími prekurzory ^[4]. Jiná izolační strategie zahrnuje modifikaci aminoskupiny cefalosporinu a jeho vykrystalizování za optimálních podmínek z okyseleného média ^[4]. Následně je doporučeno provést několik extrakčních kroků pro dosažení požadované čistoty produktu ^[4].

Výhled do budoucnosti

Dříve byl velký problém s nestabilitou surového cefalosporinu C, který se částečně rozpadal, a proto nebylo příliš možné a vhodné využívat kontinuální režim produkce ^[4]. Tento problém byl ovšem vyřešen zavedením methoxy skupiny do surového cefalosporinu C, která výrazně zvýšila jeho stabilitu ^[18]. Nyní pokračují vědci ve výzkumu snahou syntetizovat nové, semi-syntetické cefalosporiny a modifikovat stávající semi-syntetické cefalosporiny, aby se dostaly k molekulám odolným k β-laktamásám ^[18]. Stejně tak je snaha o syntézu rozpustnějších cefalosporinů a účinnější produkci cefalosporinových prekurzorů ^[18]. Velmi se také pracuje na optimalizaci kultivačních podmínek, například optimalizaci živení fermentačního procesu ^[32]. Výzkum se také zaměřuje směrem zlepšení aerace kultivačního procesu, kdy jsou pokusy o zvýšení přestupu kyslíku pomocí symbiotické imobilizace A. chrysogenum s řasami Chlorella pyrenoidosa ^[18].

Odkazy

Reference